原文出处
QiY,WuH,MaiC,LinH,ShenJ,ZhangX,GaoY,MaoY,XieX.LncRNA-MIAT-MediatedmiR--3pSilencingIsResponsibleforIL-17ProductionandCardiacFibrosisinDiabeticCardiomyopathy.FrontCellDevBiol.Apr15;8:.
研究背景
糖尿病引起的心脏纤维化可导致左心室肥厚(LVH)、舒张期和收缩期功能障碍，继而发展为糖尿病心肌病（DCM），最终可发展为心力衰竭，导致死亡。目前尚没有有效的治疗方法来预防或逆转心脏纤维化这种病理变化。长链非编码RNA(LongNon-CodingRNAs，LncRNAs)长约个核苷酸,不具有编码蛋白质的功能，但具有调控基因表达的功能。LncRNA心肌梗死相关转录本(MIAT)在内皮细胞中含量丰富，对内皮细胞迁移和血管发芽功能有调节作用。研究发现lncRNA-MIAT可作为竞争的内源RNA，通过海绵化miR-22-3p上调DAPK2的表达，从而导致心肌细胞凋亡和随后的糖尿病心肌病的发生发展。由于lncRNA作为基因表达调控因子的出现已经揭示了多种疾病的发病机制，更好地理解lncRNA调控网络将有助于进一步揭示疾病的本质，并最终促进lncRNA导向的诊断和治疗的改进。
白细胞介素-17(IL-17)是宿主炎症的关键调节因子，在心脏间质纤维化的发病机制中起着重要作用。据报道，调控IL-17表达可通过抑制lncRNA-AK抑制糖尿病小鼠心脏间质纤维化，增强心肌收缩力。鉴于lncRNA-MIAT参与了DCM的发病过程，IL-17介导的心肌间质纤维化是DCM的主要特征，作者提出假设lncRNA-MIAT是否可以调节IL-17的表达，从而促进心脏间质纤维化的发展，最终导致DCM的发生。
在该研究中，作者发现高糖处理在体外和体内都能上调IL-17的产生。在分子水平上，作者证明了高糖诱导的lncRNA-MIAT上调与IL-17的产生有关。其机制可能是由于LncRNA-MIAT特异性减弱了miR-3p介导的对IL-17表达的抑制作用。最后，作者证明了在小鼠中敲除lncRNA-MIAT显著改善了心功能并减轻了心肌纤维化。综上所述，研究首次表明，lncRNA-MIAT在DCM中起着关键作用，靶向lncRNA-MIAT可能成为治疗该病的一种潜在方法。
研究结果
结果一、LncRNA-MIAT和IL-17在糖尿病患者血清中高表达
为了确定通过调节宿主炎症而促进糖尿病心肌病发病的特异性因子，作者首先用ELISA检测了糖尿病患者血清中IL-1β、IL-6、IL-17和肿瘤坏死因子-α的蛋白表达水平。结果表明，IL-1β、IL-6、IL-17和TNF-α的蛋白表达水平均显著高于健康对照组(图1A-D)。作者还进行了qRT-PCR检测miR--3p、IL-17和lncRNA-MIAT的表达。结果发现，糖尿病患者血清中miR--3p的表达明显低于正常对照组(图1E)，而IL-17和lncRNA-MIAT的基因表达则显著上调(图1F，G)。结果表明，糖尿病患者血清中miR--3p的表达显著低于正常对照组(图1E)，而IL-17和lncRNA-MIAT的基因表达则显著上调(图1F，G)。
结果二、高糖可促进心肌细胞产生IL-17
为探究IL-17对糖尿病心肌病心脏重构的影响，作者首先对心肌细胞和成纤维细胞进行了IL-17的共聚焦免疫化学染色。C57BL/6小鼠产生的原代细胞首先通过共聚焦显微镜确认其来源，使用肌动蛋白-in和波形蛋白作为两个标记物。结果表明，与心肌细胞相比，IL-17(红色)在成纤维细胞中显著表达(图2A)。随后作者用Westernblotting验证。图2B、C显示IL-17在成纤维细胞中的蛋白表达显著高于平滑肌细胞，提示IL-17的表达与参与炎症的细胞类型高度相关。作者又测定了NG组和HG组IL-17的表达。图2D显示，与NG组相比，HG组IL-17(红色)也有明显表达。与NG组相比，HG组心脏成纤维细胞中IL-17的蛋白表达也显著增加(图2E，F)。这些结果表明高糖处理可能通过产生IL-17诱导心脏成纤维细胞炎症。
结果三、LNC-MIAT通过miR--3p调节IL-17的产生
为了研究lncRNA-MIAT在DCM发病中的作用机制，作者首先使用miRcode预测了可能与特定miRNAs结合的位点。结果表明，lncRNA-MIAT序列含有miR--3p的推测结合位点(图3A)。为了验证miR--3p的推测结合位点是否正确，作者进行了荧光素酶活性测定。结果表明，miR--3p转染可降低Luc-IL-17活性，但对Luc-IL-17-mut活性无影响。然后，将LncRNA-MIAT-siRNA或Scr-siRNA转染原代心脏成纤维细胞。用qRTPCR检测LncRNA-MIAT和IL-17的表达。结果表明，敲除lncRNA-MIAT可显著下调LncRNA-MIAT的基因表达，上调miR--3p的表达(图3B)。这些结果提示，lncRNA-MIAT对miR--3p的表达具有负性调节作用。随后，作者确定了lncRNA-MIAT是否能调节IL-17的表达。Westernblotting结果显示，敲除lncRNA-MIAT可显著降低IL-17的蛋白表达(图3C)，提示lncRNA-MIAT正向调节IL-17的产生。考虑到lncRNA-MIAT既调节miR--3p的基因表达，又调节IL-17的蛋白表达，作者怀疑lncRNA-MIAT是否通过miR--3p调节IL-17的表达。首先使用miRcode预测IL-17与miR--3p之间的可能结合位点，发现IL17序列包含miR--3p可能的结合位点(图3D)。荧光素酶检测证实miR--3p转染可降低Luc-lncRNA-MIAT活性，但对Luc-lncRNA-MIAT-mut活性无影响。为了证实miR--3p能调节IL-17的表达，首先用miR--3p或AMO-miR--3p转染原代心脏成纤维细胞，然后提取总RNA进行qPCR。结果显示，转染miR--3p可显著降低IL-17的基因表达，而AMO-miR--3p可显著上调IL-17的mRNA表达(图3E)。进一步，用Westernblotting检测了miR--3p或AMO-miR--3p处理后IL-17的蛋白表达。与相应的对照相比，miR--3p处理显著降低了IL-17的蛋白表达，而AMO-miR--3p处理显著增加了IL-17的产生，得到了类似的结果(图3F)。综上所述，这些结果提示，lncRNA-MIAT可能通过miR--3p调节IL-17的产生。
结果四、IncRNA-MIAT介导miR--3p对心肌成纤维细胞纤维化的调节作用
为了探讨炎症在糖尿病心肌病病理生理过程中发挥作用机制，作者首先检测高糖是否能促进原代心肌细胞中大量炎性细胞因子的表达，包括肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1(IL-1)β、白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-17(IL-17)。结果显示，高糖处理可显著增加原代心脏成纤维细胞培养上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17的释放(图4A-D)。由于lncRNA-MIAT是IL-17的正向调节因子，作者进一步确定在HG环境下，lncRNA-MIAT是否也能正向调节其他炎性细胞因子。结果表明，与HG处理相比，敲除LncRNA-MIAT+HG处理显著降低IL-17、TNF-α、IL-1β和IL-6的产生(图4A-D)。由于miR-3p是连接lncRNA-MIAT和下游炎性细胞因子的媒介，进一步应用AMO-miR--3p来评价阻断miR--3p是否可以减少炎性细胞因子的产生。结果表明，AMO-miR--3p处理组较相应对照组明显增加促炎细胞因子的释放，提示lncRNA-MIAT可通过miR--3p调节一组炎性细胞因子。作者对不同处理条件下的原代心脏成纤维细胞进行了IL-17的共聚焦免疫化学染色。结果与在ELISA中发现的结果相似。HG处理可显著增加心脏成纤维细胞IL-17的蛋白表达，而敲除lncRNA-MIAT可抑制IL-17的产生(图4E)。心肌I型和III型胶原的表达与心肌纤维化高度相关，严重的纤维化会损害心肌收缩力。作者接下来进行了I型胶原和III型胶原的免疫组化共聚焦染色，以确定HG是否通过I型胶原和III型胶原的升高而诱导心肌纤维化。结果表明，HG处理显著增加了I型胶原和III型胶原的产生，并且这种增加可以被抑制lncRNA-MIAT的产生(图4F，G)。最后用Westernblotting检测了IL-17、I型胶原和III型胶原的蛋白表达，结果与激光共聚焦显微镜观察到的结果一致(图4H-K)。结果表明心肌纤维化可能受lncRNA-MIAT介导的miR--3p的调节。
结果五、敲除MIAT后射血分数改善
为探究lncRNA-MIAT在体内心脏炎症中的作用，作者通过链脲佐菌素(STZ)成功建立糖尿病小鼠模型，经尾静脉注射慢病毒沉默的LncRNA-MIAT(DM+LV-siMIAT)。QRT-PCR证实成功敲除了lncRNA-MIAT。与在糖尿病患者中观察到的相似，糖尿病小鼠的lncRNA-MIAT的表达水平显著高于健康小鼠。作者观察DM+SINC治疗对血糖、LVEF%、LVFS%、心脏病理改变和IL17表达的影响。结果表明，与DM治疗相比，DM+SINC治疗对DCM的血糖水平、LVEF%、LVFS%、心脏病理改变和IL-17表达无明显影响，提示SINC可能对DCM的发生发展无明显影响。随后作者选择DM+SINC组作为DM+LV-siMIAT组和健康组的对照。图5A显示了三组之间不同的血糖模式，与DM+SINC组相比，DM+LV-siMIAT治疗显著降低了血糖。但DM+LVsiMIAT组血糖仍高于对照组(图5A)。进行超声心动图检查，分别评估三组间的LVEF%和LVFS%。结果显示，DM+LV-siMIAT治疗可使左心室射血分数(LVEF%)、左心室短轴缩短率(LVFS%)以及收缩和舒张功能部分恢复，从而显著减少DM对心肌收缩力的不利影响，提示MIAT对心肌收缩力有保护作用(图5B-D)。作者还对心脏进行了HE染色。结果表明，DM+LV-siMIAT治疗能部分恢复DM所致的心肌损伤，表现出较少的心肌损伤和炎性细胞浸润模式(图5E)。Masson染色也观察到类似的结果，表明敲除lncRNA-MIAT可以保护心脏免受高糖暴露(图5E)。结果提示，敲除lncRNA-MIAT可能成为治疗扩张型心肌病的一种潜在策略。
结果六、敲除lncRNA-MIAT可减轻心脏炎症
由于作者已经发现IL-17、I型胶原和III型胶原在HG处理的原代心肌细胞中过表达，进一步检查在活体中是否可以观察到同样的情况。作者首先进行了免疫组化(IHC)检测心脏切片中IL-17的表达。结果发现，与对照组相比，DM治疗组IL-17的表达明显上调，而DM+LV-siMIAT组的IL-17表达明显低于DM组(图6A)，而DM+LV-siMIAT组IL-17的表达明显低于DM组(图6A)。为了确认IL-17的表达是否受转录修饰的调节，然后进行定量聚合酶链反应(QPCR)检测IL17基因在三个治疗组中的表达。结果显示，DM可显著上调IL-17的基因表达，而siMIAT可下调IL-17的表达(图6B)。Westernblotting检测IL-17、IL-6、IL-1β、肿瘤坏死因子-α的蛋白表达。同样的结果显示，DM处理后IL-17、IL-6、IL-1β和肿瘤坏死因子-α的蛋白表达显著上调，而siMIAT处理则下调其蛋白表达，这与在体外观察到的结果一致(图6C、J、K)。按照同样的程序，进一步检测I型胶原和III型胶原的蛋白表达。结果表明，DM处理后I型胶原和III型胶原的蛋白表达上调，而siMALT处理在转录和翻译水平上均下调了I型胶原和III型胶原的蛋白表达。结果表明抑制MALT是预防心肌纤维化的潜在有效策略(图6D-I)。
结论
1.LncRNA-MIAT和IL-17在糖尿病患者血清中高表达，高糖环境可促进心肌细胞产生IL-17，高糖处理诱导了心脏成纤维细胞炎症的发生。
2.IncRNA-MIAT靶向miR--3p/IL-17对心肌成纤维细胞的纤维化具有调节作用。
3.敲除MIAT后心脏射血分数改善，抑制MALT可能是改善心功能和逆转心肌纤维化的潜在策略。
校对：杨格
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